ما هو تحليل PCR؟

تم تطوير تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) في الأصل في عام 1983 من قبل عالم الكيمياء الحيوية الأمريكي كاري موليس وحصل على جائزة نوبل في الكيمياء عام 1993 لعمله الرائد.

تطبيقات تحليل PCR:

  • يستخدم تفاعل البوليميراز المتسلسل في البيولوجيا الجزيئية لعمل (تضخيم) نسخ عديدة من أجزاء صغيرة من الحمض النووي؟ او جين؟
  • باستخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR)، من الممكن توليد آلاف إلى ملايين النسخ من قسم معين من الحمض النووي من كمية صغيرة جدًا من الحمض النووي.
  • PCR هي أداة شائعة تستخدم في مختبرات البحوث الطبية والبيولوجية. هل يستخدم للتسلسل في المراحل الأولى من معالجة الحمض النووي؟ للكشف عن وجود أو عدم وجود الجين الذي يساعد في التعرف على مسببات الأمراض أثناء العدوى وإنشاء صور DNA من عينات الحمض النووي الدقيقة.
  • إنه أحد اختبارات التهاب الكبد

كيف يعمل PCR؟

  • المبادئ الكامنة وراء أي PCR، بغض النظر عن عينة الحمض النووي، هي نفسها.
  • هناك خمسة “مكونات” أساسية لازمة للتحضير لـ PCR. سنشرح بالضبط ما يفعله كل من هؤلاء عندما نغادر. تفضل:
  • يتم نسخ قالب الحمض النووي
  • تم تصميم الاشعال، وهي امتدادات قصيرة من الحمض النووي التي تبدأ تفاعل البوليميراز المتسلسل، لربط جانبي امتداد الحمض النووي الذي تريد نسخه.
  • قواعد النوكليوتيدات DNA؟ (المعروف أيضًا باسم dNTPs). قواعد الحمض النووي (A و C و G و T) هي اللبنات الأساسية للحمض النووي وهي ضرورية لبناء سلسلة جديدة من الحمض النووي
  • انزيم طاق بوليميراز؟ لإضافة قواعد DNA جديدة
  • عازلة لضمان ظروف التفاعل الصحيحة.
  • يتضمن تفاعل البوليميراز المتسلسل عملية تسخين وتبريد تسمى التدوير الحراري والتي يتم تنفيذها بواسطة آلة.

ثلاث مراحل رئيسية لتحليل PCR:

تمسخ – عندما يتم تسخين قالب DNA مزدوج السلسلة لفصله إلى خيطين منفصلين.

التلدين – عندما تنخفض درجة الحرارة للسماح لبادئات الحمض النووي بالالتزام بقالب الحمض النووي.

التمدد – عندما ترتفع درجة الحرارة ويتم تكوين خيط جديد من الحمض النووي بواسطة إنزيم Taq polymerase.

  • تتكرر هذه المراحل الثلاث 20-40 مرة، مع تضاعف عدد نسخ الحمض النووي في كل مرة.
  • يمكن إجراء تفاعل PCR كامل في غضون ساعات قليلة، أو أقل من ساعة على بعض الأجهزة عالية السرعة.
  • بعد اكتمال تفاعل البلمرة المتسلسل، يمكن استخدام طريقة تسمى الرحلان الكهربائي للتحقق من كمية وحجم أجزاء الحمض النووي المنتجة.

ماذا يحدث في كل مرحلة من مراحل تحليل PCR؟

مستوى التمسخ

مرحلة غير مضطربة

  • خلال هذه المرحلة، يتم تسخين الكوكتيل مع قالب الحمض النووي وجميع المكونات الأساسية الأخرى إلى 94-95 درجة مئوية.
  • هل ارتفاع درجة الحرارة يسبب روابط هيدروجينية؟ افصل بين القواعد في خيطين من الحمض النووي للقالب وافصل بين خيطين.
  • ينتج عن هذا شريطين فرديين من الحمض النووي يهدفان إلى العمل كنماذج لإنتاج خيوط DNA جديدة.
  • من المهم الحفاظ على درجة الحرارة في هذه المرحلة لفترة كافية للتأكد من فصل خيوط الحمض النووي تمامًا.
مرحلة التوهج:
  • خلال هذه المرحلة يتم تبريد التفاعل إلى 50-65 درجة مئوية. يسمح هذا للطلاءات الأولية بربط الهيدروجين إلى موضع محدد على الحمض النووي أحادي السلسلة (تعتمد درجة الحرارة الدقيقة على درجة حرارة انصهار البادئات المستخدمة).
اشتعال
  • هل DNA أو RNA خيوط مفردة؟ التسلسل يتراوح من 20 إلى 30 قاعدة.
  • هل يجب أن تكون البادئات مكملة؟ يتضمن التسلسل نسخ الامتدادات القصيرة للحمض النووي في كل نهاية من نهايات التسلسل.
  • تعمل المواد الأولية كنقطة انطلاق لتخليق الحمض النووي. يمكن أن يضيف إنزيم البوليميراز قواعد الحمض النووي فقط إلى حبلا مزدوج للحمض النووي. فقط عندما يكون التمهيدي مرتبطًا، يمكن أن يلتصق الإنزيم البوليمري ويبدأ في إنتاج شريط DNA تكميلي جديد من قواعد الحمض النووي المفكوكة.
  • إن شريطين منفصلين من الحمض النووي مكملان ويعملان في اتجاهين متعاكسين (من أحد الطرفين – الطرف 5 – إلى الطرف الآخر – الطرف 3) ومن ثم، هناك نوعان من البادئات – الأساس التمهيدي والبادئات التمهيدية.

تستغرق هذه الخطوة عادةً حوالي 10-30 ثانية.

مرحلة التوسع:

تمديد المرحلة

  • في هذه الخطوة الأخيرة، يتم رفع درجة الحرارة إلى 72 درجة مئوية بحيث يمكن صنع DNA جديد بواسطة إنزيم DNA polymerase Taq الخاص، والذي يضيف قواعد الحمض النووي.
  • TM DNA polymerase هو إنزيم من البكتيريا المحبة للحرارة؟ ثيرموس أكواتيكوس.
  • تعيش هذه البكتيريا عادة في الينابيع الساخنة، لذا يمكنها تحمل درجات حرارة تزيد عن 80 درجة مئوية.
  • إن بوليميراز الحمض النووي البكتيري مستقر للغاية في درجات حرارة مرتفعة، مما يعني أنه يمكنه تحمل درجات الحرارة المطلوبة لتفتيت خيوط الحمض النووي في المرحلة غير المتغيرة من تفاعل البوليميراز المتسلسل.
  • إن بوليميراز الدنا المأخوذ من معظم الكائنات الحية الأخرى لن يكون قادرًا على تحمل درجات الحرارة المرتفعة، على سبيل المثال، ستعمل البوليميرات البشرية بشكل مثالي عند 37 درجة مئوية (درجة حرارة الجسم).
  • 72 درجة مئوية هي درجة الحرارة المثلى لبوليميراز Taq لبناء حبلا تكميلية. يرتبط بالبادئة ثم يضيف قواعد الحمض النووي إلى الشريط الواحد تلو الآخر في اتجاه 5 إلى 3.
  • والنتيجة هي خيط جديد من الحمض النووي وجزيء من الحمض النووي مزدوج الشريطة.
  • يعتمد طول هذه الخطوة على طول تسلسل الحمض النووي المراد تضخيمه، ولكن عادةً ما يستغرق نسخ 1000 قاعدة (1 كيلو بايت) من الحمض النووي حوالي دقيقة واحدة تقريبًا.
  • تتكرر عمليات التدوير الحراري الثلاث هذه من 20 إلى 40 مرة لإنشاء نسخ عديدة من تسلسل الحمض النووي محل الاهتمام.
  • تعمل مقاطع الحمض النووي الجديدة التي تم إنشاؤها أثناء PCR أيضًا كقوالب يمكن أن يرتبط بها إنزيم بوليميريز DNA وبدء تركيب الحمض النووي.